11 - Stato dell'arte
Testo italiano
L’interesse del nostro gruppo di ricerca é da anni focalizzato nello studio dei meccanismi coinvolti nei processi di aggregazione di proteine.
In particolare l’attività di ricerca é stata dedicata all’analisi delle cinetiche di aggregazione di proteine modello selezionate per alcune peculiarità della loro struttura nativa, in differenti condizioni sperimentali, allo scopo di evidenziare i diversi meccanismi coinvolti nelle molteplici fasi dell’aggregazione. I diversi profili caratteristici delle cinetiche di aggregazione sono stati correlati a fattori dipendenti da proprietà strutturali delle proteine, come la propensione a formare specifiche strutture secondarie, l’idrofobicità della catena o di domini specifici, la stabilità e la carica della molecola, ma anche alle proprietà fisico-chimiche dell’ambiente esterno o dalla concentrazione. Numerose tecniche sperimentali sono state usate per studiare e seguire le diverse fasi del processo di aggregazione: la spettroscopia di assorbimento IR e UV-visibile, la spettroscopia di Fluorescenza, il dicroismo circolare, il light scattering statico e dinamico e la microscopia a forza atomica. Queste tecniche hanno permesso di analizzare i processi di aggregazione su differenti scale spazio temporali e di esplorare diversi regimi di concentrazione [Manno 2004, San Biagio 1999, Militello 2003, Militello 2004, Vetri 2005 e 2007, Foderà 2008 ].
Nel regime di bassa concentrazione l’analisi dell’aggregazione di proteine globulari (BSA, Concanavalina A e BLG) ha evidenziato il ruolo fondamentale svolto dai cambiamenti conformazionali della proteina nell’evoluzione del processo. In corrispondenza di valori di pH vicini al punto isoelettrico, é stata osservata la formazione di aggregati amorfi, caratterizzati da un gran numero di conformazioni disordinate delle proteine coinvolte e da interazioni intermolecolari eterogenee; a pH intermedi, si osserva la competizione di due processi che portano rispettivamente alla formazione di una certa percentuale di strutture beta-aggregate (ordinate) e di aggregati amorfi, indicando che i diversi meccanismi coinvolti nel processo sono modulati dal pH. Invece, a valori di pH lontani dal punto isoelettrico, cioè quando la proteina é carica, la formazione di strutture non specifiche diminuisce a favore della formazione di strutture beta-aggregate, in concomitanza con modifiche della struttura secondaria. E’importante notare che quanto osservato appare indipendente dalle peculiarità della struttura della molecola in analisi. A valori di pH estremi, la struttura della proteina é destabilizzata e risulta favorita la formazione di ponti a idrogeno intermolecolari che stabilizzano le strutture ordinate. In queste condizioni, la crescita degli aggregati e le modifiche a livello della struttura secondaria procedono in parallelo. E’da sottolineare che i processi di aggregazione osservati sono sempre accompagnati da un unfolding parziale della struttura globulare.
I cambiamenti di struttura secondaria risultano essere una fase fondamentale per il processo di aggregazione ordinata ed avvengono quando le altre interazioni sono minimizzate a causa di fattori esterni. I nostri risultati sono in accordo con numerose altre osservazioni sperimentali che indicano come, per dare luogo alla formazione di fibrille, proteine con nessuna omologia strutturale come l’apo-mioglobina [Fandrich 2000], la phosphoglycerate kinase [Damaschun 2000], l’acylphosphatase [Chiti 1999], il lisozima sia umano che di gallina [Morozova-Roche 2000, Krebs 2000], la beta2-microglobulina [Jahn 2007] e l’alfa-synucleina [Uversky 2001], devono passare attraverso stadi parzialmente denaturati e subire una riorganizzazione a livello di struttura secondaria. Queste considerazioni sono applicabili in condizioni in cui non sono osservati processi di nucleazione. Ciò probabilmente deriva sia da caratteristiche strutturali delle molecole ma anche dalle condizioni ambientali: l'aggregazione sembra essere guidata da contributi entropici dovuti alle interazioni proteina-solvente piuttosto che contributi entalpici dovuti a interazioni proteina-proteina regolate da residui specifici. Sono stati osservati processi di organizzazione sovramolecolare più complessi di quelli che potrebbero essere ipotizzati a causa del carattere non nucleato del processo e che richiedono la modificazione strutturale delle singole unità che costituiscono l’aggregato. Interazioni idrofobiche ed elettrostatiche sono state riconosciute come le forze guida dell’aggregazione che portano alla formazione delle strutture beta-aggregate. Anche se i meccanismi e le interazioni che portano alla formazione di strutture fibrillari sono condivisi, le specificità strutturali della molecola influenzano sensibilmente l’evoluzione del processo (ad esempio il profilo della cinetica, le interconnessioni e i tempi caratteristici dei meccanismi coinvolti) e le energie coinvolte.
Altri aspetti del processo di aggregazione in vitro sono stati evidenziati studiando i processi di fibrillogenesi dell’insulina sia umana che bovina. L’insulina é stata usata come modello per studiare i meccanismi di nucleazione in diverse condizioni sperimentali. I risultati indicano che nel corso delle prime fasi del processo di fibrillogenesi ha luogo un processo di nucleazione primaria (omogeneo) che porta alla formazione stocastica (sia su scala temporale che spaziale) di primi aggregati stabili che diffondono nella soluzione [Librizzi 2003 e 2005, Foderà 2007 e 2008]. Tali aggregati sembrano promuovere la formazione di fibrille amiloidi in tutto il volume attraverso meccanismi di nucleazione secondaria. Numerosi meccanismi molecolari come ad esempio frammentazione, branching e nucleazione sulla superficie di fibrille già formate possono promuovere questi processi autocatalitici. Ciò ovviamente porta alla simultanea presenza nel campione una grande varietà di topologie degli aggregati. I nostri risultati contribuiscono a fare luce sia sul ruolo cruciale della superficie delle fibrille come centro di nucleazione sia sulla pronunciata eterogeneità spaziale delle prime fasi della fibrillogenesi dell’insulina.
Recentemente il ruolo degli ioni metallici come forza guida che modula i processi di aggregazione proteica ed in particolare la formazione di fibrille e’ stato oggetto di un crescente interesse. La presenza di questi ioni può indurre infatti l’aggregazione controllando i tempi caratteristici dell’associazione sovra molecolare e inoltre può influenzare significativamente la morfologia degli aggregati [Dong, 2006] attraverso differenti effetti di coordinazione con l’environment [Dong, 2006]. Ciò, in condizioni specifiche, sembra essere correlato alla capacità dei metalli di modulare la crescita delle strutture beta-sheet e la loro interazione ordinata (sheet/sheet). Questa proprietà si basa sulla possibilità che i metalli divalenti hanno di agire da ponte tra residui specifici ma anche di fornire uno schermaggio elettrostatico tra gruppi di molecole vicine caricati negativamente [Iyer 1996, Bryant 1998, Remondetto 2003].
In questo panorama noi ci siamo occupati di studiare l’effetto degli ioni Zn2+ and Cu2+ sulle cinetiche di aggregazione di due proteine modello (BLG e BSA) evidenziandone gli effetti differenti sull’evoluzione temporale dell’aggregazione indotta termicamente [Navarra 2007 and 2008]. I risultati hanno mostrato che la presenza del Cu2+ influenza la cinetica principalmente a livello delle modifiche di struttura secondaria e terziaria, ed induce la formazione di legami ad idrogeno più forti; nonostante ciò, la cinetica di aggregazione sovramolecolare non appare modificata. Sembra, invece, che la presenza di Zn2+ non influenzi significativamente l’evoluzione temporale della struttura secondaria e terziaria ma che porti ad una drastica modificazione della cinetica di associazione intermolecolare con la conseguente rapida formazione di aggregati di maggiori dimensioni.
Testo inglese
Our research group has focused the interest on the analysis of protein aggregation processes. In particular, the thermal aggregation kinetics of selected model proteins, characterized by different native structures, where used to point out different mechanisms involved in the aggregation pathways.
The characteristics of the aggregation kinetics were related to several factors dependent on protein structure, such as secondary structural preferences, hydrophobicity, protein stability, and charges, as well as arising from the physic-chemical environment or protein concentration. Spectroscopic methods have been used to follow protein aggregation pathways in a time-resolved approach by means several experimental techniques: Absorption Spectroscopy in infrared (IR) and UV-Visible ranges; steady-state fluorescence spectroscopy; circular dichroism (CD), static and dynamic light scattering; Atomic Force Microscopy (AFM). These techniques allowed to study the aggregation processes in different space time scale and to explore different concentration regimes [Manno. 2004, San Biagio 1999, Militello 2003, Militello 2004, Vetri 2005, Vetri . 2005, Vetri 2007, Foderà 2008].
In low concentration regime the analysis of globular proteins (BSA, Concanavalin A, BLG), revealed the main role of conformational changes in aggregation pathway. At pH close to isoelectric point amorphous aggregates are formed, these aggregates are characterized by multiple disordered protein conformations and heterogeneous intermolecular interactions, at intermediate pH the formation of a certain percentage of beta-aggregate structure is also observable, thus indicating interplay of different mechanisms modulated by pH. In correspondence of further changes of pH away from isoelectric point a decrease of non specific structures occurs and a secondary structure conversion takes place toward beta-aggregate structures and that behavior is found to be independent on protein structural details. At extreme pH the whole protein is destabilized and during the aggregation pathway intermolecular H-bonds (strengthened in hydrophobic environment),which stabilize the ordered structures, are favored. In those conditions aggregates growth and structural modifications proceed in parallel. The observed aggregation mechanism was always accompanied by partial unfolding of protein globular-structure.In particular, modifications at secondary structure level appear to be fundamental phases of ordered aggregation pathways. Our result are in agreement with several other experimental observations indicating that proteins with no structural similarity such as apo-myoglobin [Fandrich 2000], phosphoglycerate kinase [Damaschun 2000], acylphosphatase [Chiti 1999] human and hen lysozymes [Morozova-Roche 2000, Krebs 2000], and beta2-microglobulin [Jahn 2007] alfa-synucleyn [Uversky 2001] and others need to be partially unfolded and reorganised in their secondary structure in order to undergo to fibril formation.
These considerations are applicable in conditions in which the occurrence of nucleated process is not observed. This probably arises both from peculiar characteristics of the molecules but also (and probably mainly) by the selected solution conditions: entropic contributions due to protein-solvent interactions rather than enthalpic ones due to residue specific protein-protein interactions seems to drive the aggregation. In all the observed cases, the aggregation pathway is more complex than the plain stepwise accretion which could be inferred from the non-nucleated character of self assembly. Hydrophobic and electrostatic interactions have been recognized as the driving forces leading the molecule to the common b-aggregate structure. Even if the mechanisms leading to fibril-like aggregation are shared among the common properties of proteins, the specificity of molecule sizably affects the pathway (i.e. the kinetic, the interconnections and the rates of the involved mechanisms) and the “energetic” of the process.
Different aspects related to the in vitro fibrils formation have been taken into account studying Bovine and Human insulin fibrillation processes. Insulin was used as a model to study nucleation mechanisms involved. Results have suggested that in particular conditions during fibrillation pathway a primary (homogeneous) nucleation takes place in the early stages of the process followed by stochastic (temporally and spatially) formation of the first stable aggregates that, diffusing through the solution [Librizzi 2003, 2005, Fodera’ 2007, Fodera’ 2008]. Such stable aggregates likely promote the formation of amyloid fibrils in the whole sample volume by secondary nucleation mechanism. Several molecular mechanisms can produce such autocatalytic process like fragmentation, branching and nucleation at the surface of already formed fibrils, this obviously result in a variety of morphology of the formed fibril. The crucial role of the fibrils surface as nucleation point has also been elucidated together with the pronounced spatial heterogeneity that characterizes the early stages of the process.
Recently, there has been growing interest in the role of metal ions as a driving force to modulate the protein aggregation and fibril formation. The presence of these ions can induce aggregation and significantly also can specifically control the rate of self-assembly and dramatically regulate amyloid morphology via distinct coordination environments [Dong, 2006].It was suggested that this effect, in specific conditions, is related to their ability in modulate β-sheet growth and sheet/sheet packing. This properties is probably based on the ability of divalent metals to act as bridges between specific residues, as well as to provide an electrostatic screening between the negatively charged groups of the neighbouring protein molecules [Iyer1996, Bryant 1998, Remondetto 2003]. In this context we have studied the effect of Zn2+ and Cu2+ on the aggregation kinetics of two model protein (BLG and BSA) highlighting the different effects of Cu2+ and Zn2+ on the time evolution of the heat-induced aggregation process [Navarra 2007 and 2008]. Results indicates that Cu2+ presence mainly affects the time evolution of the protein secondary and tertiary structure changes in the early stages of aggregation, and its presence induces the formation of stronger H-linked bonds, but the time evolution of supramolecular assemblies is not affected. On the opposite, the presence of Zn2+ appears to slightly affect the conformational and structural changes of the protein but to dramatically influence the formation of big aggregates leading to the faster formation of large assemblies.
13 - Descrizione del programma e dei compiti dell'Unità di Ricerca
Testo italiano
L’aggregazione di proteine e in particolare la formazione di fibrille sono processi comuni a tutte le catene polipeptidiche che dipendeno dalla natura e dalla carica elettrica delle singole catene laterali [López de la Paz 2004, Chiti 2003, Krebs 2007]. Sotto specifiche condizioni di destabilizzazione, quali temperature elevate, valori estremi di pH o presenza di sostanze denaturanti, anche proteine non direttamente collegate a patologie possono organizzarsi a formare strutture regolari di ordine superiore che ricordano quelle amiloidi. Queste strutture sono considerate ad oggi gli elementi chiave della citotossicità e le cause di una larga varietà di malattie legate alla amiloidosi [Kim 2003, Bitan 2006, Zamotin 2006, Gharibyan 2007]. In genere, nel processo di formazione delle fibrille è stata osservata la presenza di forme intermedie, quali oligomeri o proto-fibrille ed è stato ipotizzato che l’ordine strutturale aumenta passando dagli oligomeri alla proto fibrille e, successivamente, alle fibrille [Kodali 2007]. Misure di “imaging” e "light scattering” mostrano che gli oligomeri appaiono spesso di piccole dimensioni e di forma sferica. Le proto-fibrille hanno invece una forma non-sferica ed oblunga senza una sotto-struttura periodica, del tipo “rod-like” o “worm-like”. Le fibrille, infine, mostrano ai raggi X generalmente una struttura elicoidale, costituita da una distribuzione di beta-sheet lungo un asse preferenziale di elongazione (strutture cross-beta) [Jiménez 1999, Holm 2007]. I meccanismi alla base della crescita di fibrille amiloidi rappresentano un punto cruciale da chiarire anche in vista delle implicazioni biomedicali. Le specie aggregate di una stessa proteina ma caratterizzate da ben distinte tipologie (quali intrecci o distribuzione parallele di proto-fibrille) mostrano significativi e differenti effetti sulle culture cellulari [Petkova 2005, Kreplak 2006, Herczenik 2008]. E' stato dimostrato che differenti morfologie delle fibrille del peptide Abeta 1-40 hanno significative e differenti tossicità in culture cellulari neuronali [Petkova 2005].
Obiettivo della nostra ricerca sarà la caratterizzazione della morfologia degli aggregati del peptide Abeta (beta amiloide) in diverse fasi del processo di aggregazione e in funzione delle condizioni esterne. Questo studio sarà effettuato guardando anche ai cambiamenti conformazionali e strutturali che si verificano durante il processo di aggregazione.
Il peptide Abeta è stato selezionato come un modello per lo studio di fenomeni di aggregazione applicabile ad altri peptidi e proteine. Abeta è un peptide di 39/43 residui, principale componente di placche amiloidi nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. Il processo di aggregazione di peptidi Abeta è stato ampiamente studiato con una serie di tecniche sperimentali. Durante la formazione di fibrille mature e ordinate del peptide Abeta si osservano differenti specie transienti, quali piccoli oligomeri solubili e insolubili, protofibrille e polimeri insolubili, fibrille amiloidi con una conformazione beta-sheet. È interessante notare che la morfologia finale degli aggregati fibrillari e la loro struttura molecolare sono fortemente influenzate dalla condizioni di crescita. Ciò è stato attribuito alla presenza di almeno due distinti meccanismi di nucleazione [Petkova 2005], tra cui meccanismi spazialmente eterogenei come quello recentemente proposto per l'insulina [Librizzi 2005e 2007, Foderà 2007].
Noi vogliamo indagare le variazioni strutturali a livello morfologico e molecolare nelle varie fasi del processo di aggregazione fibrillare di differenti peptidi Abeta. In particolare, studieremo i processi di aggregazione, in differenti condizioni sperimentali, dei peptidi sintetici Abeta 1-40 e 1-42 (Biopeptide Co) e Abeta 25-35, fornito dall’Unità di Roma "La Sapienza". In collaborazione con l’Unità del CNR, verrà analizzata l'influenza di due molecole naturali, l'acido ferulico e l’ipericina, sulle diverse specie intermedie. Recenti studi hanno infatti mostrato come queste molecole naturali siano in grado di interagire con il peptide Abeta, stabilizzando o distruggendo gli aggregati di differenti dimensioni. Verrà inoltre caratterizzato in vitro l'effetto di peptidi “beta-sheet breaker”, sintetizzati dall’Unità di Roma "La Sapienza". Questi peptidi riducono significativamente le deposizione in vivo di proteine beta-amiloidi e bloccano completamente la formazione di fibrille amiloidi nel cervello di ratto [Soto 1996 e 1998, Wisniewski 2008]. Infatti, una serie di studi indicano che l’interazione peptide-peptide, che produce fenomeni di auto-organizzazione del peptide Abeta, può essere modulata e influenzata da piccole molecole organiche [Pappolla 1998, De Felice 2007], che potrebbero anche essere efficaci strumenti terapeutici per marcare le specie oligomeriche e fibrillari.
In parallelo con l'attività scientifica dell’Unità di Roma Tor Vergata, studieremo l'effetto di ioni di metalli di transizione Zn2 + + CU2. Questi ioni sono state selezionati in quanto coinvolti sia nella formazione di fibrille del peptide Abeta che nella neuropatologia della malattia di Alzheimer [Bush 1994]. Il peptide Abeta contiene più siti intermoleculari di legame per lo Zn2+ e CU2+ [Bush 1994, Craig 2000, Miura 2000]; inoltre, legami intermoleculari dello Zn2+ possono promuovere l'aggregazione del peptide Abeta. È interessante notare che lo ione CU2+ sembra avere sia un effetto inibitorio che di promozione del meccanismo di fibrillazione [Atwood 1998, Zhou 2001, Suzuki 2001]. Sotto condizioni sperimentali leggermente diverse, le differenze nella coordinazione di CU2+ probabilmente modificano sia le cinetiche che la morfologia degli aggregati [Pektkova 2005]; questa caratteristica sarà studiata attraverso l’analisi delle strutture degli aggregati intermedi.
I processi di aggregazione del peptide Abeta saranno indotti in soluzione attraverso l'aumento della temperatura. Grande attenzione sarà posta sulla scelta di condizioni ambientali vicine a quelle fisiologiche. L'evoluzione temporale delle cinetiche di aggregazione sarà seguita con le tecniche di “light scattering” e fluorescenza. Le misure di “light scattering” saranno utilizzate per ottenere informazioni sulla crescita degli aggregati macromolecolari in soluzione durante il processo di aggregazione, mentre le cinetiche di emissione di fluorescenza dell’1-anilino-8-naftalensolfonato (ANS) e della Thioflavina T (THT) saranno analizzate per seguire la crescita dei clusters idrofobici e delle strutture fibrillari. La fluorescenza stazionaria e risolta in tempo dell’ANS può dare interessanti informazioni sulle proprietà delle cavità idrofobiche nello stato nativo della proteina e nelle strutture supramolecolari e sulla loro evoluzione temporale. L'interesse è legato al ruolo essenziale che le interazioni idrofobiche svolgono nella stabilizzazione delle strutture proteiche o viceversa nella loro destabilizzazione e aggregazione. La Thioflavina T (THT) è un colorante fluorescente ampiamente utilizzato "in situ" per osservare la presenza di fibrille amiloidi e la loro crescita. La THT libera in soluzione presenta una debole banda di emissione, mentre l’interazione con le fibrille amiloidi porta ad un aumento notevole della sua fluorescenza, la cui intensità sembra dipendere in maniera lineare dalla concentrazione di aggregati [Naiki 1989, Levine 1993, Levine 1999]. Il rendimento quantistico della THT può variare notevolmente a seconda della morfologia dell’amiloide, come recentemente dimostrato per diversi tipi di fibrille del glucagone [Pedersen 2006]. Inoltre, studi sul legame di THT con fibrille di insulina hanno mostrato la presenza di almeno due siti di legame individuati uno tra i proto-filamenti che formano le proto-fibrille, l’altro tra le proto-fibrille che formando le fibrille mature, con la THT disposta lungo l'asse parallelo all’asse fibrillare [Groenning 2007, Foderà 2007].
Noi analizzeremo la morfologia degli assemblati supramolecolari a differenti e significativi stadi del processo di aggregazione mediante le tecniche di AFM (microscopia a forza atomica), microscopia confocale e due fotoni. L'analisi sistematica degli aggregati su diverse scale di lunghezza e di tempo può dare nuove informazioni sulle specie di aggregati tossici, anche in relazione con la loro struttura molecolare.
La microscopia a Forza Atomica (AFM) di imaging differisce dalla microscopia convenzionale perché comporta la scansione della superficie dei campioni in condizioni di differente idratazione. L’AFM é particolarmente utile per l'individuazione della morfologia delle fibrille e per l'identificazione di piccole specie con risoluzione nanometrica. La lunghezza, lo spessore e la forma delle fibrille possono essere facilmente visualizzati.
La microscopia a fluorescenza sarà utilizzata sia per la caratterizzazione di grandi aggregati che per l'analisi della citotossicità delle differenti specie di aggregati. A secondo il campione, verrà utilizzata la microscopia confocale o quella a due fotoni. Entrambe le tecniche consentono l'ottenimento di immagini ad alta risoluzione ottica su campioni fluorescenti sia "fissati" su opportuni substrati che in vivo. La microscopia confocale consente di raccogliere, in maniera non invasiva, sezioni puntuali (0.5-1.5 micron) da campioni spessi; questo, insieme con i recenti progressi sull’utilizzo di proteine e sonde fluorescenti, hanno consentito di osservare processi biologici in cellule vive, in 3D e in tempo reale. Per la microscopia a due fotoni, l’eccitazione del fluoroforo (e quindi l'emissione) si verifica solo sul piano focale del microscopio; questo confina spazialmente la zona di eccitazione con notevoli vantaggi soprattutto per le immagini 3D. Inoltre, la profondità di penetrazione del fascio di eccitazione è aumentata. Infine, l’estrema localizzazione del volume di eccitazione a due fotoni riduce in maniera significativa sia il “photobleaching” che il “photodamage”, condizione particolarmente importante per campioni biologici, e in particolare per le cellule viventi. Nello studio dei processi di aggregazione alcune delle questioni principali riguardano la grande eterogeneità delle strutture che si vengono a formare, l’ordine della reazione di questi processi multi-moleculari e la elevata sensibilità alle condizioni sperimentali. In questo schema, la capacità di ottenere immagini delle molecole coinvolte nella reazione, o la struttura dei grandi aggregati può dare nuove informazioni sulla comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti. È stato dimostrato [Digman 2008a, 2008 Dalal, Digman 2008b, Digman 2009] che un certo numero di informazioni sono contenute nelle immagini confocali, e in particolare la tecnica di correlazione delle immagini può essere usata per rilevare e analizzare le dinamiche di diffusione e di legame. Tali tecniche possono essere utilizzate sia su campioni in soluzione che su idonee matrici per analizzare a fondo i meccanismi di aggregazione tenendo conto della non uniformità spaziale del processo. L'analisi delle immagini di strutture aggregate che legano la THT può fornire interessanti informazioni sulla localizzazione dei siti di legame di questo colorante e, di conseguenza, sulla struttura molecolare degli aggregati.
In collaborazione con l'Unità CNR, queste tecniche di microscopia di fluorescenza saranno usate per studiare la tossicità delle differenti specie di aggregati su opportune linee cellulari.
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Testo inglese
Proteins aggregation and, in particular, fibrils formation configure as common property of any polypeptide chain modulated by the nature and charge of the side-chains [López de la Paz 2004, Chiti 2003, Krebs 2007]. Indeed, under specific destabilizing conditions, i.e. high temperature, extreme pH values or in the presence of denaturant, even proteins not related to pathologies can self-assembly forming regular structures which resemble the ones involved in the amyloidoses. These structures as of today are believed to be key effectors of cytotoxicity and to cause a variety of amyloid related diseases [Kim 2003, Bitan 2006, Zamotin 2006, Gharibyan 2007]. During fibrils formation, different intermediate species, like small oligomers or protofibrils, are commonly observed. It was suggested that the structural order increases from oligomers to protofibrils to fibrils [Kodali 2007]. When examined by imaging or light scattering techniques, oligomers often appear small and spherical when compared to protofibrils and fibrils. Protofibrils are distinguishable for non-spherical elongated structures without a periodic substructure and may resemble rod-like or worm-like fibrils. Fibrils commonly display a general template, as revealed by X-ray or electron diffraction, consisting in a helicoidal distribution of beta-sheet structure running perpendicularly around an elongation axis (cross-beta structures) [Jiménez 1999, Holm 2007]. The mechanisms underlying the growth of amyloid fibrils represent one of the crucial points that need to be clarified also in relation whit the biomedical implication. Aggregated species rising from the same protein but characterised by distinct morphologies (e.g. twisted or parallel assemblies of protofibrils) exhibit significantly different behaviours in cell cultures [Petkova 2005 Kreplak 2006 Herczenik 2008]. For example, it has been demonstrates that different Ab1–40 fibril morphologies also have significantly different toxicities in neuronal cell cultures [Petkova 2005].
Aim of our research will be a characterisation of the morphology of Abeta (beta amiloid) aggregates at different steps of the aggregation pathway, depending on external conditions. This study will be carried out also in relation with changes at molecular structure level that occurs during the aggregation pathway.
Abeta peptide was selected as a relevant model for studying aggregation phenomena and approaches for stabilization that may be generally applicable to other proteins and peptides. Abeta is a peptide of 39/43 residues, main constituent of amyloid plaques in the brains of Alzheimer's disease patients. The aggregation process of Abeta peptide was largely investigated with a number experimental technique. Its ability to form fibrils, similar to the ones found in Alzheimer’s plaques, is well established. During the formation of ordered mature fibrils multiple transient species occur; among them, soluble and insoluble small oligomers, protofibrils and insoluble polymers, amyloid fibrils with a beta-sheet conformation. Interestingly, the final morphology of fibrillar aggregates and their molecular structure are strongly affected by the growth conditions. This was attributed to the occurrence of at least two distinct nucleation mechanisms [Petkova 2005].It is possible to infer that spatially heterogeneous mechanisms like the one recently suggested for insulin are implicated in the changing morphology of these aggregates [Librizzi 2005, 2007, Fodera’ 2007]. We want to deeply investigate the interconnection between morphological and molecular-level structural variations.
Aggregation of Abeta synthetic peptides Abeta 1-40 and 1-42 (Biopeptide Co) and Abeta 25-35 provided by Roma “La Sapienza” unit will be studied in different environmental conditions. In collaboration with the CNR Unit, the influence of two natural molecules, the ferulic acid and the hypericin, on the occurrence of different intermediate species will be analysed at different point of the Abeta aggregation process to elucidate how these molecules alter the equilibrium between the aggregating species. We will also test in vitro during the aggregation kinetic the effect of beta sheet breaker peptides, synthesized by the Roma “La Sapienza” unit. These peptides significantly reduce amyloid beta-protein deposition in vivo and completely block the formation of amyloid fibrils in a rat brain model of amyloidosis [Soto 1996,1998, Wisniewski 2008]. Indeed, a number of studies indicate that ppeptide–peptide interactions resulting in self-assembly phenomena of Abeta can be modulated and influenced by small organic molecules [Pappolla 1998, De Felice 2007] that might also be effective therapeutic tools to ideally target both oligomeric and fibrillar species.
In parallel with the scientific activity of the Roma Tor Vergata Unit, the effect of the transition metal ions Zn2+, Cu2+ will be investigated. These ions were selected since they were found to contribute both to Abeta fibril formation and to the neuropathology of Alzheimer's disease [Bush 1994]. Moreover, the Abeta peptide contains multiple intermolecular binding sites for Zn2+ and Cu2+ [Bush 1994, Craig 2000, Miura 2000] and intermolecular Zn2+ binding can promote Abeta aggregation being crucial for the assembly mechanisms. Interestingly, Cu2+ was reported to have both inhibitory and promoting effect on fibrillation mechanism [Atwood 1998, Zhou 2001, Suzuki 2001]. Under slightly different experimental conditions, differences in Cu2+ coordination probably affects both kinetics and morphologies [Pektkova 2005]; this feature can be deeply investigated though the exam of the intermediate aggregate structures topologies.
Abeta aggregation will be induced in solution through temperature increase. In particular, a great care will be focused on environmental conditions close to the physiological ones. The time evolution of aggregation kinetic will be monitored by light scattering and fluorescence technique. Light scattering will be used to obtain information on the growth of macromolecular assemblies in solution during the aggregation pathway, while 1-anilino-8-naphthalenesulfonate (ANS) and Thioflavin T (ThT) emission kinetics will be analyzed to monitor the growth of hydrophobic cluster and of fibrillar structures.
ANS steady state fluorescence and its time evolution can give interesting insight on hydrophobic cavities both in native protein structures and in new supramolecular assemblies and on their evolution. Interest in such information is conditioned by the essential role that the hydrophobic interactions play in the protein stabilization or conversely in its destabilisation and aggregation.
Thioflavin T (ThT) is a fluorescent dye widely used to “in situ” monitor amyloid fibril presence and growth. It is well known that free ThT presents a weak emission band, whereas upon interaction with amyloid fibril its fluorescence is sizably enhanced, and its intensity appears to be, in a good approximation, linearly dependent on the amount of aggregates [Naiki 1989, LeVine 1993, LeVine 1999] Interestingly, ThT quantum yield may vary considerably depending on the morphology of the amyloid, as recently shown for different types of glucagon fibrils [Pedersen 2006]. Moreover, recent studies on binding of ThT to insulin fibrils showed the presence of at least two binding sites possibly individuated between protofilaments forming the protofibrils, or between the protofibrils forming the mature fibrils, with the ThT long axis parallel to the fibril axis [Groenning 2007, Fodera’ 2007].
At significant points of the aggregation pathway, the morphology of supramolecular assemblies will be proved by means AFM (Atomic force microscopy), Confocal Microscopy and two photon Microscopy. The systematic analysis of aggregates at different time and length scales can give new insight in the individuation of the toxic aggregated specie also in relation with their molecular structure.
Atomic Force Microscopy (AFM) imaging is fundamentally different from conventional microscopy since it involves the scanning of the specimen surface hydrated conditions. AFM results are particularly useful for the detection of the fibril morphologies and for the identification of small species with nanometric resolution. Fibril length, thickness and shape can be easily visualized.
Fluorescence microscopy will be used both for the characterisation of fixed large aggregates and for the analysis of cytotoxicity of different aggregation species. Depending on the sample, Confocal or 2-photon excitation microscopy will be used. Both techniques allow obtaining high resolution optical images both of fixed and living fluorescent specimens. Confocal microscopy allow to non invasively collect optical sections (0.5-1.5 micron) from thick specimens; this feature, together with recent advances in fluorescent proteins and dyes technology, have allowed to monitor biological processes in live cells in 3D and in real time. For two-photon microscopy, the fluorophore excitation (and thus emission) occurs only at the focal plane of the microscope; this feature spatially confines two-photon excitation giving rise to several advantages especially in 3D imaging. Moreover, penetration depth of the excitation beam is increased. Importantly for biological samples, and especially for living cells, the localisation of excitation volume of two-photon excitation markedly reduces overall photobleaching and photodamage.
In the study of aggregation processes some of the main issues are the large heterogeneity of structures formed, the high reaction orders of such multimolecular processes, and the exquisite sensitivity to solution conditions. In this context, the ability of directly imaging the molecules involved in the reaction, or the structure of large aggregates can give new insight on the comprehension of the general molecular mechanisms. It has been demonstrated [Digman 2008a, Dalal 2008, Digman 2008b, Digman 2009] that a number of information are contained in confocal images, and in particular imaging correlation techniques can be used to detect and analyse diffusion and binding dynamic of molecules in images. Those techniques can be used both on samples in solution or in suitable matrices to deeply analyse aggregation mechanisms taking in account the spatial non uniformity of the process. The analysis of images of aggregated structures which bind Thioflavin T can give interesting insight on the localisation of the binding sites of this dye, providing in turn information on aggregate molecular structure.
High resolution images can give information on the localization and/or the co localisation of the proteins/aggregates, evidencing the role of target sites.
So, in collaboration with the CNR unit, those fluorescence microscopy techniques will be used to study the cytotoxic effect of the different aggregate species on suitable cell lines.
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